Лабораторная для студентов вирусологические методы исследования. Методы вирусологических исследований

Вирусологические исследования

Лабораторная для студентов вирусологические методы исследования. Методы вирусологических исследований

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Вирусологические исследования

fВзятие патологического материала для вирусологических исследований

При взятии вируссодержащего патологического материала большое значение имеет правильность выбора материала и его свежесть. Вирусы очень чувствительны к нагреванию и гниению.

Поэтому материал надо брать от свежих трупов (не позднее 12 часов после гибели), а еще лучше от убитых клинически больных животных.

При выборе материала учитывают тропизм вирусов и клиническое проявление болезни, вид и возраст животного, стадию течения болезни, наличие видимых изменений в органах и тканях и т.д.

При жизни животного в качестве вируссодержащего материала можно использовать: афты и их содержимое (ящур), пустулы (оспа), слизь и смывы со слизистых, моча (чума свиней и др.

), кровь и лимфа (при пантропных инфекциях). Посмертно кроме указанных материалов берут кусочки паренхиматозных и других органов (печень, селезенка, почки, мозг, лимфотические узлы).

Трупы мелких животных направляют обычно целиком.

Берут материал по возможности стерильно при помощи стерильных инструментов и в стерильную посуду. Если лаборатория рядом, материал отправляют в неконсервированным и обычно в термосе со льдом. Если же материал надо транспортировать далеко, то его обычно консервируют и тщательно упаковывают (особенно, если отправляют по почте или самолетом).

Кусочки органов консервируют в 50% стерильном глицерине или в насыщенном растворе хлорида натрия и дополнительно помещают в термос со льдом. Жидкий материал консервируют замораживанием и сохраняют при -20о С (в термосе с сухим льдом).

К материалу прилагают сопроводительный документ, в котором указывают эпизоотологические, клинические и патологоанатомические данные.

Лабораторные методы диагностики вирусных болезней

После постановки предварительного диагноза на вирусную болезнь, его необходимо подтвердить лабораторными исследованиями. Последние включают два метода:

Вирусологический метод (Аг – х)

Включает исследование патологического материала на наличие вируса.

1.Обнаружение вирусамикроскопия мазков:

а) обычная световая (на наличие телец-включений); люминесцентная (МФ – метод флуорохромирования, МФА- метод флуоресцирующих антител); ИФА – иммуноферментный анализ; электронная;

б) индикация вирусов -РГА (реакция гемагглютинации), РГАд (реакция гемадсорбции).

в) ПЦР.

г) электронная микроскопия

2.Выделение вирусов путем заражения чувствительных биологических моделей:

• лабораторных животных;

• куриных эмбрионов (КЭ);

• культур тканей (КТ);

3. Идентификация вируса (определение вида), типизация (определение типа, варианта) и дифференциация.

Проводят путем постановки серологических реакций с известными биофабричными биофабричными иммунными сыворотками, с помощьюПЦР и электронномикроскопически.

Серологический метод (применяют исследуемые сыворотки на наличие антител), постановка реакций с известными биофабричными вирусными антигенами. РДП, РИЭОФ, РЗГА, РНГА, РСК, МФА, ИФА, РЗГАд, РН.

Подготовка патологического материала для лабораторнойдиагностики.

Присланный в лабораторию материал принимают, и по возможности, сразу начинают исследование, если же такой возможности нет, то его хранят до начала исследований в холодильнике при -20о С.

Подготовку материала к вирусологическим исследованиям начинают с осмотра органов и тканей, если они были консервированы, их отмывают физраствором от консерванта.

Если труп поступил целый, сначала его осматривают, а затем проводят вскрытие, измененные органы тщательно осматривают, извлекают и помещают в стерильные флаконы, или чашки Петри. При подозрении на бешенство часто присылают голову трупа. В этом случае, ее осматривают, а затем вскрывают и извлекают мозг.

Жидкий материал проверяют на бактериальную загрязненность микроскопией мазков и посевом на среды (МПБ, МПА, среду Киитт-Тароцци и среду Сабуро) и при необходимости обрабатывают антибиотиками (пеницилин и стрептимицин по 500-2000 ЕД на мл среды в зависимости от степени загрязненности). патологический вирусный биологический

Из кусочков органов готовят суспензию. Для этого из присланных органов и тканей берут небольшие кусочки (1-1,5 г) и помещают в стерильную ступку, где после измельчения ножницами тщательно растирают до кашицеобразной массы со стерильным песком или стеклом.

Затем добавляют стерильный физраствор в соотношении 1:5 или 1:10 и получается суспензия. Ее переносят в центрифужные пробирки и туда же вносят вышеуказанные антибиотики в тех же дозах. Суспензию в пробирках 2-3 раза замораживают (при -20о,-50оС) и оставляют при комнатной температуре или в термостате при 37о С.

При этом происходит дополнительное разрушение клеток и освобождение вируса. Затем пробирки с суспензией центрифугируют 15-20 минут при 3000 об./мин.

Надосадочную жидкость проверяют на стерильность посевом на среды в аэробные и анаэробные условия и затем используют как вируссодержащий материал для: заражения лабораторных животных; заражения куриных эмбрионов; заражения культур тканей; постановки серологических реакций в качестве антигена.

Одновременно из исходного патматериала готовят мазки или мазки-отпечатки, которые исследуют на наличие телец-включений и вируса в клетках, после специальной окраски под обычным микроскопом или применяют люминесцентную микроскопию с использованием иммунофлуоресценции (флуоресцирующие антитела). При необходимости можно из органов готовить гистосрезы и исследовать их гистологически (например, при бешенстве).

Выделение вируса проводят на развивающихся куриных эмбрионах, в культуре тканей и на лабораторных животных

Выделение вирусов на лабораторных животных.

Выбор лабораторных животных зависит от вида вируса. Лабораторные животные являются биологической моделью.

Иногда приходится проводить 3-5 “слепых”, безсимптомных пассажей, прежде чем удастся адаптировать вирус к лабораторным условиям.

Однако, к некоторым вирусам лабораторные животные не чувствительны, в этом случае приходится использовать естественно восприимчивых животных. Как, например, при чуме свиней и инфекционной анемии лошадей.

Цель заражения лабораторных животных.

Изучить патогенез болезни; выделить вирус из пат. материала; наработка иммунных и гипериммунных сывороток; наработка вакцин; поддержание вирусов в условиях лаборатории; титрация, с целью определения количества вируса в единице объема; биологическая модель для постановки реакции нейтрализации.

Выбор метода заражения лабораторных животных зависит от тропизма вируса. Так, при культивировании нейротропных вирусов животных заражают в мозг; респираторных интранозально, интратрахеально; дерматропных – подкожно и внутрикожно.

Заражение производят с соблюдением правил асептики и антисептики.

Различают много Способы заражения животных: подкожный; – интрацеребральный; внутрикожный; интраперитониальный; внутримышечный; интраокулярный; внутривенный; интранозальный; алиментарный.

После заражения животных метят, помещают их в изолированный бокс и ведут наблюдение в течение 10 суток. Гибель животного в первые сутки после заражения считается неспецифичной и в дальнейшем не учитывается.

3 признака указывают на результативность заражения: наличие клинических признаков, гибель животного, патологоанатомические изменения (величины, формы, цвета и консистенции органа).

Выделение вирусов на куриных эмбрионах

Куриный эмбрион – это оплодотворенное куриное яйцо, в котором развивается зародыш (эмбрион). Культивирование вирусов на куриных и перепелиных эмбрионах в последнее время получило широкое распространение как один из наиболее простых и надежных методов культивирования и диагностики многих вирусов и некоторых бактерий – бруцеллы, риккетсии, вибрионы.

Многие вирусы человека и животных способны культивироваться в развивающихся куриных эмбрионах. Эмбриональная ткань, особенно оболочки эмбриона, богатые тканями зародышевого эпителия, является благоприятной средой для размножения многих вирусов. Вирусы, имеющие эпителиотропные свойства (оспа, ИЛТ и др.

), успешно развиваются на хорионаллантоисной мембране, вызывая макроскопически видимые изменения. Различные представители миксовирусов (грипп, болезнь Ньюкасла, чума плотоядных и др.), вирусы инфекционного бронхита, гепатита утят, арбовирусы и др. хорошо размножаются в эмбрионе при введении материала в аллантоисную полость.

Некоторые вирусы успешно культивируются в желточном мешке.

Преимущества: экономически выгодно, кроме того яйца легко доступны.

У развивающихся куриных эмбрионов отсутствуют защитные механизмы, т.к. система иммунитета еще не развита;

Скорлупа яиц препятствует проникновению через неё бактерий и вирусов из окружающей среды;

Для культивирования и выделения вирусов на куриных эмбрионах требуется очень несложное оборудование – обычный термостат или инкубатор.

Условия:

1. Яйца получают из хозяйств заведомо благополучных по инфекционным заболеваниям;

2. Куриные эмбрионы лучше получать от белых пород кур (леггорн, русская белая), т. к. они более устойчивы к манипуляциям и не гибнут от маленьких травм. Кроме того, у них скорлупа белая и более прозрачная, чем у других пород, и легче просвечивается, что удобно для просмотра и наблюдения в процессе работы с ними;

3. Для инкубирования отбирают оплодотворенные яйца снесенные не более 10 суток тому назад;

4. Берут незагрязненные яйца, т. к. мыть их перед инкубированием нельзя, а грязные яйца хуже просвечиваются при просмотре (овоскопии) и при работе с ними можно инфицировать эмбрион в процессе манипулирования;

Инкубируют яйца в инкубаторе или в термостате с водяным нагревом и доступом воздуха, причем в процессе инкубации в термостате яйца 2-3 раза в сутки нужно переворачивать и для лучшего газообмена вынимать на 5-10 минут на воздух. Для поддержания определенной влажности в термостат ставят сосуд с водой для испарения, температура в термостате должна быть 38°.

Развитие зародыша происходит уже в первые сутки инкубирования, происходит закладка головного мозга, скелета. Строение куриного эмбриона в возрасте 7-9 дней.

Для заражения наиболее часто используют эмбрионы 7-12 суточного возраста. Работу с куриными эмбрионами проводят в стерильной комнате-боксе со строжайшим соблюдением асептики.

Цель заражения куриных эмбрионов: –выделить вирус из пат. материала; для приготовления живых и убитых вакцин; поддержание вируса в условиях лаборатории; – титрация вирусов; -биологическая модель для постановки реакции нейтрализации; – изучение интерференции вирусов и наработка интерферона;

Заражение куриных эмбрионов:

Для заражения нужно отбирать жизнеспособные эмбрионы с хорошо выраженной подвижностью. Перед заражением все эмбрионы тщательно просматривают в затемненной комнате на овоскопе. Доза заражения составляет 0,1-0,2 смз.

В зависимости от вида вируса и цели заражения имеются различные методы введения вируссодержащего материала: Заражение на хориоаллантоисную оболочку. Заражение в аллантоисную полость.

Заражение в желточный мешок. Заражение в амниотическую полость Заражение в тело эмбриона и заражение в головной мозг. Заражение в крупные кровеносные сосуды.

После заражения куриные эмбрионы ставят в термостат. Их ежедневно овоскопируют в течение 7-8 суток в зависимости от вида вируса.

Если эмбрион погиб в течение первых 14-18 часов после заражения, то гибель считается неспецифической и в дальнейшем не учитывается.

Поэтому, так же как и при заражении лабораторных животных, в сомнительных случаях рекомендуется, делать несколько пассажей и в опыт брать на каждый материал по несколько эмбрионов.

После вскрытия погибших зараженных куриных эмбрионов наблюдают характерные изменения, вызванные вирусом. Наиболее часто поражения наблюдают на хориоаллантоисной оболочке: появляются кровоизлияния и воспалительные очаги круглой формы. Кровоизлияния могут быть на теле эмбриона. Весь материал собирают в стерильную посуду.

Размещено на Allbest.ru

Источник: https://otherreferats.allbest.ru/medicine/00376170_0.html

Вирусологический метод, основные этапы

Лабораторная для студентов вирусологические методы исследования. Методы вирусологических исследований

Этиологическая диагностика вирусных заболеваний проводится вирусологическим, вирусоскопическим, серологическим и молекулярно-генетическим методами. Три последних метода могут быть использованы как экспресс-диагностические.

Вирусологический метод диагностики.

Конечной целью метода является идентификация вирусов до вида или серологического варианта. Вирусологический метод включает несколько этапов:

1) отбор материала для исследования;

2) обработку вируссодержащего материала;

3) заражение материалом чувствительных живых систем;

4) индикацию вирусов в живых системах;

5) титрование выделенных вирусов;

6) идентификацию вирусов в иммунных реакциях.

1. Отбор материала для исследования.

Проводится в ранние сроки заболевания при соблюдении правил, предотвращающих контаминацию материала посторонней микрофлорой и инфицирование медицинского персонала.

Для предупреждения инактивации вирусов при транспортировке материала, он помещается в вирусную транспортировочную среду (ВТС), состоящую из сбалансированного солевого раствора, антибиотиков и сывороточного альбумина. Транспортируется материал в специальном контейнере с термоизоляцией и закрытыми пластиковыми пакетами, содержащими лед.

При необходимости материал хранят при -20˚С. Каждый образец материала для исследования должен иметь маркировку и этикетку с указанием фамилии больного, типа материала, даты его забора, развернутый клинический диагноз и другие сведения.

В зависимости от характера заболевания, материалом для исследования могут быть:

1) смывы с носовой части глотки и мазок из глотки;

2) спинномозговая жидкость;

3) кал и ректальные мазки;

4) кровь;

5) моча;

6) жидкость из серозных полостей;

7) мазок с конъюнктивы;

8) содержимое везикул;

8) секционный материал.

Для получения смыва из ротоглотки используют 15-20 мл ВТС. Больной тщательно в течение 1 минуты полощет горло ВТС и собирает смыв в стерильный флакон.

Мазок с задней стенки глотки берут стерильным ватным тампоном, надавливая на корень языка шпателем. Тампон помещают в 2-3 мл ВТС, ополаскивают и отжимают.

Спинномозговую жидкость получают при спинномозговой пункции. 1-2 мл спинномозговой жидкости помещают в стерильную посуду и доставляют в лабораторию.

Пробы кала отбирают в течение 2-3 дней в стерильные флаконы. Из полученного материала готовят 10 % суспензию с использованием раствора Хенкса. Суспензию центрифугируют при 3000 об/мин, собирают надосадочную жидкость, вносят в нее антибиотики и помещают в стерильную посуду.

Кровь, полученную при венепункции в объеме 5-10 мл, дефибринируют путем добавления гепарина. Цельную кровь не замораживают, антибиотики не добавляют. Для получения сыворотки пробы крови выдерживают в термостате при 37˚С в течение 60 минут.

Жидкость из серозных полостей получают при их пункции в количестве 1-2 мл. Жидкость используется сразу или сохраняется в замороженном состоянии.

Мазок с конъюнктивы берут стерильным тампоном и помещают в ВТС, после чего проводят центрифугирование взятого материала и его замораживание.

Содержимое везикул отсасывают шприцем с тонкой иглой и помещают в ВТС. Материал посылается в лабораторию в виде высушенных мазков на предметных стеклах или в запаянных стерильных капиллярах или ампулах.

Секционный материал отбирают в возможно ранние сроки, соблюдая правила асептики. Для отбора каждой пробы используют отдельные наборы стерильных инструментов. Количество отбираемых тканей составляет 1-3 г, которые помещают в стерильные флаконы. Вначале берут пробы внеполостных органов (мозг, лимфатические узлы и др.).

Ткани грудной полости берут до вскрытия брюшной полости. Полученные образцы тканей растирают в ступке с добавлением стерильного песка и стерильного раствора натрия хлорид, после чего материал центрифугируют. Надосадочную жидкость собирают во флаконы, добавляют антибиотики.

Материал для вирусологического исследования используется сразу или хранится при -20˚С.

2. Обработка вируссодержащего материала.

Проводится с целью освобождения материала от сопутствующей бактериальной микрофлоры. Для этого используются физические и химические методы.

Физические методы:

1) фильтрование через различные бактериальные фильтры;

2) центрифугирование.

Химические методы:

1) обработка материала эфиром в случаях выделения вирусов, не имеющих суперкапсида;

2) добавление к материалу смеси гептана и фреона;

3) внесение антибиотиков (пенициллин – 200-300 ЕД/мл; стрептомицин – 200-500 мкг/мл; нистатин – 100-1000 ЕД/мл).

3. Заражение материалом чувствительных живых систем.

Поскольку вирусы являются облигатными внутриклеточными паразитами, для их размножения используют следующие живые системы:

1) лабораторные животные;

2) куриные эмбрионы;

3) культуры органов;

4) культуры тканей.

Лабораторные животные. Используются белые мыши, морские свинки, хомяки, кролики и др. Белые мыши наиболее чувствительны к большому числу видов вирусов. Способ заражения животных определяется тропизмом вируса к тканям.

Заражение в мозг применяется при выделении нейротропных вирусов (вирусы бешенства, полиовирусы и др.). Интраназальное заражение проводят при выделении возбудителей респираторных инфекций. Широко используются внутримышечный, внутривенный, внутрибрюшинный, подкожный и другие методы заражения.

Заболевших животных усыпляют эфиром, вскрывают и производят забор материала из органов и тканей.

Куриные эмбрионы. Широко доступны и просты в работе. Применяют куриные эмбрионы в возрасте от 5 до 14 дней.

Перед заражением куриные эмбрионы овоскопируют: определяют их жизнеспособность, отмечают на скорлупе границу воздушного мешка и месторасположение эмбриона («темный глаз» эмбриона).

Работа с куриными эмбрионами проводится в стерильном боксе стерильными инструментами (пинцеты, шприцы, ножницы, копье и др.). После выполнения фрагмента работы инструменты погружают в 70 % этиловый спирт и перед следующей манипуляцией прожигают.

Перед заражением скорлупу куриного эмбриона протирают горящим спиртовым тампоном и спиртовым раствором йода. Объем исследуемого материала, вводимого в эмбрион, составляет 0,1-0,2 мл. Для выделения вирусов из одного материала используют не менее 4 куриных эмбрионов.

Источник: https://cyberpedia.su/5x9377.html

Вирусологические методы исследования — Медицинская энциклопедия

Лабораторная для студентов вирусологические методы исследования. Методы вирусологических исследований

Вирусологи́ческие методы исследования

Методы изучения биологии вирусов и их идентификации. В вирусологии широко используются методы молекулярной биологии, с помощью которых удалось установить молекулярную структуру вирусных частиц, способы проникновения их в клетку и особенности репродукции вирусов, первичной структуры вирусных нуклеиновых кислот и белков.

Развиваются методы определения последовательности составляющих элементов вирусных нуклеиновых кислот и аминокислот белка.

Появляется возможность связать функции нуклеиновых кислот и кодируемых ими белков с последовательностью нуклеотидов и установить причины внутриклеточных процессов, играющих важную роль в патогенезе вирусной инфекции.

Вирусологические методы исследования основаны также на иммунологических процессах (взаимодействие антигена с антителами), биологических свойствах вируса (способность к гемагглютинации, гемолизу, ферментативная активность), особенностях взаимодействия вируса с клеткой-хозяином (характер цитопатического эффекта, образование внутриклеточных включений и т.д.).

В диагностике вирусных инфекций, при культивировании, выделении и идентификации вирусов, а также при получении вакцинных препаратов широко применяют метод культуры ткани и клеток. Используют первичные, вторичные, стабильные перевиваемые и диплоидные клеточные культуры.

Первичные культуры получают при диспергировании ткани протеолитическими ферментами (трипсином, коллагеназой). Источником клеток могут быть ткани и органы (чаще почки) эмбрионов человека и животных.

Суспензию клеток в питательной среде помещают в так называемые матрацы, бутыли или чашки Петри, где после прикрепления к поверхности сосуда клетки начинают размножаться. Для заражения вирусами используют обычно клеточный монослой.

Питательную жидкость сливают, вносят вирусную суспензию в определенных разведениях и после контакта с клетками добавляют свежую питательную среду, обычно без сыворотки.

Клетки большинства первичных культур могут быть пересеяны, такая культура называется вторичной. При дальнейшем пассировании клеток формируется популяция фибробластоподобных клеток, способных к быстрому размножению, большая часть которых сохраняет исходный набор хромосом.

Это так называемые диплоидные клетки. При серийном культивировании клеток получают стабильные перевиваемые клеточные культуры. При пассажах появляются быстро делящиеся однородные клетки с гетероплоидным набором хромосом. Стабильные линии клеток могут быть однослойными и суспензионными.

Однослойные культуры растут в виде сплошного слоя на поверхности стекла, суспензионные — в виде суспензий в различных сосудах с использованием перемешивающих устройств. Существует более 400 линий клеток, полученных от 40 различных видов животных (в т.ч.

от приматов, птиц, рептилий, амфибий, рыб, насекомых) и человека.

В искусственных питательных средах можно культивировать кусочки отдельных органов и тканей (органные культуры). Эти типы культур сохраняют структуру ткани, что особенно важно для выделения и пассирования вирусов, которые не репродуцируются в недифференцированных тканевых культурах (например, коронавирусы).

В зараженных клеточных культурах вирусы можно обнаружить по изменению морфологии клеток, цитопатическому действию, которое может иметь специфический характер, появлению включений, путем определения вирусных антигенов в клетке и в культуральной жидкости; установления биологических свойств вирусного потомства в культуральной жидкости и титрования вирусов в культуре ткани, куриных эмбрионах или на чувствительных животных; путем выявления отдельных вирусных нуклеиновых кислот в клетках методом молекулярной гибридизации или скоплений нуклеиновых кислот цитохимическим методом с помощью люминесцентной микроскопии.

Выделение вирусов является трудоемким и длительным процессом. Его осуществляют с целью определения циркулирующего среди населения типа или варианта вируса (например, для идентификации сероварианта вируса гриппа, дикого или вакцинного штамма вируса полиомиелита и т.д.

); в случаях, когда это необходимо для проведения срочных эпидемиологических мероприятий; при появлении новых типов или вариантов вирусов; при необходимости подтверждения предварительного диагноза; для индикации вирусов в объектах окружающей среды.

При выделении вирусов учитывают возможность их персистирования в организме человека, а также возникновения смешанной инфекции, вызванной двумя и более вирусами.

Генетически однородная популяция вируса, полученная от одного вириона, называется вирусным клоном, а сам процесс получения его — клонированием.

Для выделения вирусов применяют заражение восприимчивых лабораторных животных, куриных эмбрионов, но чаще всего используют культуру ткани.

Наличие вируса обычно определяют по специфической дегенерации клеток (цитопатический эффект), образованию симпластов и синцитиев, обнаружению внутриклеточных включений, а также специфического антигена, выявляемого с помощью методов иммунофлюоресценции, гемадсорбции, гемагглютинации (у гемагглютинирующих вирусов) и т.д. Эти признаки могут обнаруживаться лишь после 2—3 пассажей вируса.

Для выделения ряда вирусов, например вирусов гриппа, используют куриные эмбрионы, для выделения некоторых вирусов Коксаки и ряда арбовирусов — новорожденных мышей. Идентификацию выделенных вирусов проводят с помощью серологических реакций и других методов.

При работе с вирусами определяют их титр. Титрование вирусов проводят обычно в культуре ткани, определяя наибольшее разведение вируссодержащей жидкости, при котором происходит дегенерация ткани, образуются включения и вирусоспецифические антигены.

Для титрования ряда вирусов можно использовать метод бляшек. Бляшки, или негативные колонии вирусов, представляют собой очаги разрушенных под действием вируса клеток однослойной культуры ткани под агаровым покрытием.

Подсчет колоний позволяет провести количественный анализ инфекционной активности вирусов из расчета, что одна инфекционная частица вируса образует одну бляшку.

Бляшки выявляют путем окрашивания культуры прижизненными красителями, обычно нейтральным красным; бляшки не адсорбируют краситель и поэтому видны как светлые пятна на фоне окрашенных живых клеток. Титр вируса выражают числом бляшкообразующих единиц в 1 мл.

Очистку и концентрацию вирусов обычно осуществляют путем дифференциального ультрацентрифугирования с последующим центрифугированием в градиентах концентраций или плотности. Для очистки вирусов применяют иммунологические методы, ионно-обменную хроматографию, иммуносорбенты и т.д.

Лабораторная диагностика вирусных инфекций включает обнаружение возбудителя или его компонентов в клиническом материале; выделение вируса из этого материала; серодиагностику. Выбор метода лабораторной диагностики в каждом отдельном случае зависит от характера заболевания, периода болезни и возможностей лаборатории.

Современная диагностика вирусных инфекций основана на экспресс-методах, позволяющих получать ответ через несколько часов после взятия клинического материала в ранние сроки после заболевания, К ним относятся электронная и иммунная электронная микроскопия, а также иммунофлюоресценция, метод молекулярной гибридизации, выявление антител класса lgM и др.

Электронная микроскопия вирусов, окрашенных методом негативного контрастирования, позволяет дифференцировать вирусы и определять их концентрацию. Применение электронной микроскопии в диагностике вирусных инфекций ограничивается теми случаями, когда концентрация вирусных частиц в клиническом материале достаточно высокая (105 в 1 мл и выше).

Недостатком метода является невозможность отличать вирусы, принадлежащие к одной таксономической группе. Этот недостаток устраняется путем использования иммунной электронной микроскопии.

Метод основан на образовании иммунных комплексов при добавлении специфической сыворотки к вирусным частицам, при этом происходит одновременная концентрация вирусных частиц, позволяющая идентифицировать их. Метод применяют также для выявления антител.

В целях экспресс-диагностики проводят электронно-микроскопическое исследование экстрактов тканей, фекалий, жидкости из везикул, секретов из носоглотки. Электронную микроскопию широко используют для изучения морфогенеза вируса, ее возможности расширяются при применении меченых антител.

Метод молекулярной гибридизации, основанный на выявлении вирусоспецифических нуклеиновых кислот, позволяет обнаружить единичные копии генов и по степени чувствительности не имеет себе равных. Реакция основана на гибридизации комплементарных нитей ДНК или РНК (зондов) и формировании двунитчатых структур.

Наиболее дешевым зондом является клонированная рекомбинантная ДНК. Зонд метят радиоактивными предшественниками (обычно радиоактивным фосфором). Перспективно использование колориметрических реакций.

Существует несколько вариантов молекулярной гибридизации: точечная, блот-гибридизация, сэндвич-гибридизация, гибридизация in situ и др.

Антитела класса lgM появляются раньше, чем антитела класса G (на 3—5-й день болезни) и исчезают через несколько недель, поэтому их обнаружение свидетельствует о только что перенесенной инфекции. Антитела класса lgM выявляют методом иммунофлюоресценции или с помощью иммуноферментного анализа, используя анти- μ-антисыворотки (сыворотки против тяжелых цепей lgM).

Серологические методы в вирусологии основаны на классических иммунологических реакциях (см.

Иммунологические методы исследования): реакции связывания комплемента, торможения гемагглютинации, биологической нейтрализации, иммунодиффузии, непрямой гемагглютинации, радиального гемолиза, иммунофлюоресценции, иммуноферментного, радиоиммунного анализа.

Разработаны микрометоды многих реакций, техника их непрерывно совершенствуются.

Эти методы используют для идентификации вирусов с помощью набора известных сывороток и для серодиагностики с целью определения нарастания антител во второй сыворотке по сравнению с первой (первую сыворотку берут в первые дни после заболевания, вторую — через 2—3 нед.). Диагностическое значение имеет не менее чем четырехкратное нарастание антител во второй сыворотке. Если выявление антител класса lgM свидетельствует о недавно перенесенной инфекции, то антитела класса lgC сохраняются в течение нескольких лет, а иногда и пожизненно.

Для идентификации индивидуальных антигенов вирусов и антител к ним в сложных смесях без предварительной очистки белков используют иммуноблоттинг. Метод сочетает фракционирование белков с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующей иммуноиндикацией белков иммуноферментным методом.

Разделение белков снижает требования к химической чистоте антигена и позволяет выявлять индивидуальные пары антиген — антитело.

Такая задача актуальна, например, при серодиагностике ВИЧ-инфекции, где ложноположительные реакции иммуноферментного анализа обусловлены наличием антител к клеточным антигенам, которые присутствуют в результате недостаточной очистки вирусных белков.

Идентификация антител в сыворотках больных к внутренним и наружным вирусным антигенам позволяет определять стадию заболевания, а при анализе популяций — изменчивость вирусных белков. Иммуноблоттинг при ВИЧ-инфекции применяют как подтверждающий тест для выявления индивидуальных вирусных антигенов и антител к ним.

При анализе популяций метод используют для определения изменчивости вирусных белков. Большая ценность метода заключается в возможности анализа антигенов, синтезируемых с помощью технологии рекомбинантных ДНК, установлении их размеров и наличия антигенных детерминант.

Библиогр.: Букринская А.Г. Вирусология, М., 1986; Вирусология, Методы, под ред. Б. Мейхи, пер. с англ., М., 1988; Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, под ред. М.О. Биргера, М., 1982.

Источник: Медицинская энциклопедия на Gufo.me

Источник: https://gufo.me/dict/medical_encyclopedia/%D0%92%D0%B8%D1%80%D1%83%D1%81%D0%BE%D0%BB%D0%BE%D0%B3%D0%B8%D1%87%D0%B5%D1%81%D0%BA%D0%B8%D0%B5_%D0%BC%D0%B5%D1%82%D0%BE%D0%B4%D1%8B_%D0%B8%D1%81%D1%81%D0%BB%D0%B5%D0%B4%D0%BE%D0%B2%D0%B0%D0%BD%D0%B8%D1%8F

Вирусологические методы исследования в микробиологии

Лабораторная для студентов вирусологические методы исследования. Методы вирусологических исследований

В медицине разработаны специальные методы исследования для диагностики заболеваний с вирусной природой. Это необходимо, чтобы идентифицировать вирус, изучить его биологию и способность воздействовать на клетки животного и человека. Таким образом, появляется возможность понять патогенез вирусных заболеваний и, соответственно, правильно выбрать методику лечения.

В чем заключается диагностика?

Вирусы размножаются в живых клетках. Чтобы его исследовать, необходимо культивирование на уровне подопытного организма или культуры клеток. Для этого в медицинской практике и микробиологии в целом проводятся вирусологические методы исследования, которые имеют следующие основные подходы:

  • прямой;
  • непрямой;
  • серологический.

Пенализация и депенализация – это… Понятие, определение и виды в уголовном праве

Материал могут исследовать непосредственно на наличие нуклеиновых кислот, вирусного антигена или, например, изолировать и идентифицировать вирус из клинического материала.

Кроме возможности установить этиологию заболевания, мониторинга терапевтического эффекта, вирусологические методы исследования играют большую роль в противоэпидемических мероприятиях. Для выделения и культивирования вируса используют куриные эмбрионы, лабораторных животных или культуры клеток.

Как исследуют?

Канал ДНЕВНИК ПРОГРАММИСТА Жизнь программиста и интересные обзоры всего. , чтобы не пропустить новые видео.

Самый быстрый – это прямой метод. Он позволяет обнаружить вирус, антиген или НК (нуклеиновую кислоту) в самом клиническом материале. Занимает время от двух часов до суток.

  • ЭМ – электронная микроскопия. Обнаруживает непосредственно вирус.
  • ИЭМ – иммунная электронная микроскопия. Использует специфические антитела к вирусам.
  • РИФ – реакция иммунофлюоресценции. Использует антитела, связанные с красителем. Такие вирусологические методы исследования широко применяются в качестве быстрой расшифровки этиологии ОРВИ (острых респираторных вирусных инфекций), когда берут мазки-отпечатки со слизистой оболочки верхних дыхательных путей.
  • ИФА – иммуноферментный анализ – определение вирусных антигенов, похожее на РИФ, но основанное на мечении антител ферментами.
  • РИА – радиоиммунный анализ. Использует метку антител радиоизотопами для обеспечения высокой чувствительности в определении вирусного антигена.
  • Молекулярный – гибридизация НК или выделение геномов вируса при помощи ПЦР (полимеразной цепной реакции).
  • Цитология – применяется редко, но при определенных инфекциях эти вирусологические методы исследования очень эффективны. Исследуются материалы биопсии, аутопсии и мазки, обрабатываемые с целью окрашивания и анализа под микроскопом.
  • В чем смысл исследований?

    Куда направлен вектор импульса тела? Чему сонаправлен вектор импульса тела?

    Для успешного выделения вирусов клинический материал берут в соответствии с патогенезом и как можно раньше. Часто этот процесс требует проведения нескольких пассажей, прежде чем применить определенные вирусологические методы исследования.

    Микробиология изучает микроскопические существа. И ее область – это не только медицина. Она является основополагающей наукой для сельского хозяйства, ветеринарии, космической и технической промышленности, геологии.

    Но безусловно все создано для человека и его развития на этой прекрасной планете. Поэтому очень важно вовремя обнаружить опасность и нейтрализовать ее. Вирусы отличны от бактерий.

    Это структуры, попадающие в организм и вызывающие образование нового поколения.

    Они похожи на кристаллы и направлены на управление процессом своего размножения, хотя сами не питаются, не растут и не выделяют продуктов обмена.

    Вирус способен вызвать тяжелое заболевание у любого живого организма, в который он попал. К тому же он может эволюционировать. Именно поэтому вирусологические методы исследования в микробиологии должны развиваться и совершенствоваться, так как под угрозой может быть человеческая цивилизация в целом.

    Материалы

    Для обнаружения и идентификации вирусов в медицине, как правило, берутся:

    • носоглоточный смыв (респираторные инфекции);
    • смыв и фекалии (энтеровирусные инфекции);
    • соскобы, содержимое пузырьков (поражения кожи, слизистых оболочек, как герпес, ветряная оспа);
    • смывы (экзантемные инфекции, как корь, краснуха);
    • кровь, спинномозговая жидкость (арбовирусные инфекции).

    Фазы

    Все этапы вирусологического метода исследования включают в себя:

    • забор материала;
    • выбор, получение тест-системы, определение ее жизнеспособности;
    • заражение тест-системы;
    • индикация вируса;
    • определение типа вируса.

    В основном, патогенные вирусы отличаются наличием тканевой и типовой специфичности. Взять, к примеру, полиовирус, который репродуцируется только у приматов (в их клетках). Соответственно, для выделения определенного вируса используют определенную культуру ткани. Если речь идет о неизвестном возбудителе, то целесообразно будет одномоментно заразить три, а лучше четыре культуры клеток.

    Таким образом, возможно, одна из них окажется чувствительной. Чтобы определить наличие вируса в зараженных культурах, смотрят на развитие специфической дегенерации клеток, внутриклеточные включения, выявление специфического антигена, положительные реакции гемагглютинации и гемадсорбции.

    Все вирусологические методы исследования (прямые и непрямые, серологические) должны быть выбраны, как наиболее подходящие для конкретного случая предполагаемого инфицирования.

    Непрямые методы основываются на выделении и идентификации вируса. Они трудоемкие, длительные, но точные.

    Серодиагностика

    Под такой диагностикой подразумевается метод, основанный на реакции антиген-антитело. Чаще всего используют парные сыворотки крови, взятые с интервалом в несколько недель.

    Если нарастание титра антител в 4 и больше раз, реакцию считают за положительную. Чтобы определить типоспецифичность вируса, применяют реакцию вируснейтрализации.

    Для определения группоспецифичности нужно получить реакцию связывания комплемента.

    Широко используют различные варианты иммуноферментного анализа, реакции торможения гемагглютинации, пассивной гемагглютинации, обратной пассивной гемагглютинации, РИФ.

    Еще в генной инженерии был разработан метод получения моноклональных антител. Преодолеть узкую специфичность моноклонов можно применением нескольких моноклональных антител к различным вирусным детерминантам.

    Таким образом, была повышена специфичность и чувствительность исследования с определением антигенов.

    Некоторые особенности

    Сегодня создано много разных тест-систем для иммунологической диагностики инфекций, возникших вследствие попадания вируса в живой организм.

    Таким образом, вирусологические методы исследования – это способы выделения вирусов, изучение их свойств и установление их этиологической связи с определенными заболеваниями.

    Что касается животных, используемых в этих исследованиях, то они должны быть достаточно восприимчивы к определенной вирусной инфекции, они не должны являться носителями латентной инфекции и каких-то паразитов.

    Значение также имеет вид животного, его возраст, порода, вес тела, упитанность, половая принадлежность и условия содержания. В опыте участвуют животные одного вида, возраста, с одинаковыми условиями содержания.

    Иногда могут быть использованы разные виды животных, с различной чувствительностью к одному и тому же вирусу. Это помогает выявить все разнообразие инфекционных форм.

    Источник

    Источник: https://1Ku.ru/obrazovanie/29062-virusologicheskie-metody-issledovanija-v-mikrobiologii/

    Взятие и подготовка материала для вирусологической диагностики

    Лабораторная для студентов вирусологические методы исследования. Методы вирусологических исследований

    Вирусологическому исследованию подвергают содержимое везикул, пустул, соскобы эпителия, спинномозговую жидкость, фекалии, мазки и смывы из верхних дыхательных путей, взятые у больного с соблюдением правил асептики в ранние стадии вирусной инфекции.

    Мазки из носоглотки и кожные соскобы помещают в ИРХН или раствор Хенкса с 10% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиками (для подавления сопутствующей микрофлоры). Исследуемый материал хранят и пересылают в вирусологическую лабораторию в специальных контейнерах с сухим льдом.

    Пробы можно сохранять в условиях глубокой заморозки (-700 С).

    Вирусологический метод

    Поскольку вирусы относятся к облигатным внутриклеточным паразитам и на искусственных питательных средах не растут, для их культивирования применяются живые системы (культуры клеток, развивающиеся куриные эмбрионы, чувствительные лабораторные животные).

    Выделение вирусов на культурах клеток

    В практике вирусологических лабораторий для выделения вирусов используют первично-трипсинированные, полуперевиваемые (дип­лоидные) и перевиваемые клеточные культуры.

    Первично-трипсинированные культуры клеток можно получить из любых органов и тканей человека, животных, насекомых, растений, однако наиболее часто используются эмбриональные ткани (фибробласты куриного эмбриона, человека, и др.), обладающие повышенной способностью к росту и размножению.

    Для получения клеточной взвеситкань отмывают от крови в растворе Хенкса, измельчают ножницами и несколько раз обрабатывают трипсином на магнитной мешалке или путем пипетирования.

    Затем взвесь клеток отмывают от трипсина раствором Хенкса путем центрифугирования при 600 об/мин в течение 5—10 мин, ресуспендируют в питательной среде и определяют концен­трацию клеток в камере Горяева.

    Клеточную взвесь разводят питательной средой (обычно среда № 199 с добавлением сыворотки крупного рогатого скота) до концентрации 4-8х105 клеток в 1 мл, разливают в культуральные сосуды, закрывают резиновыми пробками. Пробирки укладывают под углом 50.

    Культивирование клеток осуществляют в термостате при 35-370 С 48-96 часов, в течение которых формируется монослой клеток, прикрепляющийся к поверхности стекла (или пластика).

    С помощью версена (натриевая соль этилендиаминотетрауксусной кислоты – ЭДТА) (реже трипсина), клетки можно снять с поверхности культуральной емкости и перенести их в другую емкость (произвести пассаж).

    Для этого в сосуды с клетками после отсасывания питательной среды наливают 0,02% ра­створ версена или 0,25% трипсина и помещают их на 3-5 мин в термостат.

    Затем версен или трипсин удаляют, в культуральный сосуд добавляют небольшое количество питательной среды, в которой суспендируют клетки, подсчитывают их количество, доводят их до требуемой концентрации и разли­вают в новые флаконы. Однако первично-трипсинизированные клеточные культуры не выдерживают более 5-10 пассажей.

    Перевиваемые клеточные культуры,в отличие от первично-трипсинированных, переносят неограниченное число пассажей, так как обычно их получают из опухолевых клеток, имеющих высокие способности к росту.

    Широкое распространение в вирусологии получили культуры клеток карциномы шейки матки (HeLa),раковой опухоли гортани (НЕр-2),костного мозга больного раком легких (Detroit-б) и т.д.

    Созданы «банки» перевиваемых клеточных культур, в которых хранятся клетки, замороженные жид­ким азотом.

    Полуперевиваемые (диплоидные) культурыполучают путем нескольких пассажей, в результате чего формируется популяция клеток, способных выдержать до 60 пассажей, быстро размножаться, быть высокочувствительными ко многим вирусам, сохраняя при этом исходный набор хромосом.

    Для культивирования клеток используются специальные стерильные питательные среды (например, среды 199, Игла, гидролизат лактальбумина и др.) с рН 7,2-7,6, содержащие полный набор аминокислот, витамины, факторы роста и набор минеральных веществ, к которым добавляют от 2 до 30 % сыворотки крови животных (сыворотка крупного рогатого скота, эмбриональная телячья сыворотка и др.

    ), а также антибиотики для предотвращения роста бактериальной флоры. Среды содержат индикатор феноловый красный, который имеет оранжево-желтый цвет при кислой реакции среды и красно-малиновый цвет в щелочной среде. Поддерживающие среды либо не содержат сыворотки, либо содержат ее в небольшом количестве. Их применяют для сохранения вырос­ших клеток после заражения их вирусами.

    Для выделения вирусов питательную среду из пробирок с культурой клеток удаляют, про­мывают монослой клеток раствором Хенкса для удаления сывороточных антител и ингибиторов, после чего в пробирку вносят 0,1-0,2 мл обработанного вируссодержащего материала. Через 30-60 мин после заражения материал из пробирки удаляют, вносят 1 мл поддер­живающей среды и пробирки помещают в термостат при 370 С для культивирования.

    Выделение вирусов на развивающихся куриных эмбрионах

    Для культивирования вирусов используют6-15-дневные ку­риные эмбрионы. Заражение осуществляют на хорион-аллантоисную оболочку (ХАО), в желточный мешок, полость амниона и аллантоиса.

    При заражении на ХАО скорлупу обрабатывают спиртом, йодом и снова спир­том. Скорлупу прокалывают над воздушным мешком, а сбоку в скорлупе делают отверстие размером 7×2 мм.

    Не повреждая оболочку под скорлупой, короткой тонкой иглой шприца наносят на ХАО 0,1—0,2 мл вирусосодержащего материала.

    Заражение в полость аллантоиса осуществляют путем введенияисследуе­мого материала шприцем на глу­бину 10—15 мм через боковое отверстие в скорлупе.

    В полость амниона вирусосодержащий матери­ал вводят через отверстие на тупом конце яйца, при этом игла шприца должна быть направлена к телу эмбриона.

    Дефекты скорлупы заливают стерильным парафином и эмбрионы помещают в термостат.

    Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

    Источник: https://studopedia.ru/10_139725_vzyatie-i-podgotovka-materiala-dlya-virusologicheskoy-diagnostiki.html

    МедЗабота
    Добавить комментарий